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CRISPR/CAS9, un nouvel outil au laboratoire

La technologie CRISPR/CAS9 (Prix Nobel de Chimie 2020) est révolutionnaire dans la catégorie des « ciseaux moléculaires », par sa simplicité et son faible coût de mise en œuvre. Guidée par l’ARN qui lui est associé, l’endonucléase CAS9 coupe spécifiquement la séquence d’ADN ciblée (région d’intérêt). La coupure double-brins est le plus souvent résolue par jointures d’extrémités non homologues (NHEJ) générant des indels (knock-out du gène ciblé). En transfectant un ADN matrice parallèlement au système exprimant CAS/ARN guide, l’ADN coupé peut être réparé de manière contrôlée par recombinaison homologue, voire modifié (mutation ponctuelle, insertion d’étiquette myc, fusion d’un gène rapporteur …)

Nous avons mis en place au laboratoire les outils biologiques nécessaires à l’utilisation de cette technologie en plein essor :

  • Nous utilisons un plasmide d’expression de la protéine eSpCAS9 (CAS9 de haute fidélité), dans lequel toute séquence cible peut être clonée pour que les cellules transfectées synthétisent eSpCAS9 et un ARN guide spécifique : on peut ainsi cibler n’importe quel gène d’intérêt pour le « couper ».
  • Pour une réparation « contrôlée » avec insertion de GFP par exemple, nous construisons un plasmide matrice contenant la séquence codant GFP, flanquée de régions homologues à la région ciblée (autour du site de coupure par CAS9). Un gène de résistance à un antibiotique (Puromycine ou Blasticidine) est inclus dans l’insert pour sélectionner les clones édités.

Voici deux exemples d’insertion réussie de la séquence GFP dans le génome de cellules de souris en culture, par la technique CRISPR/CAS9 :

Image 1 : Cellules de peau exprimant constitutivement GFP-Actine-β, ce qui rend fluorescent le réseau cellulaire de filaments

Image 2 : Macrophages produisant de la protéine fluorescente GFP après activation du promoteur de TNF-α par du LPS

 

Cette technologie est aujourd’hui déclinée en plusieurs variantes « non coupantes » pour lesquelles la CAS9 est désactivée (dCAS9) et couplée à divers effecteurs, ce qui offre de nouvelles possibilités d’action sur l’ADN génomique (modifications épigénétiques, activation/inhibition de gènes).

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